干扰素刺激基因15（ISG15）是一种诱导型修饰蛋白，主要响应 I 型干扰素（IFNs）和病原体相关分子模式（PAMPs）。ISG15可以与多种蛋白质靶点相互作用或修饰，在病毒感染、细胞外囊泡（EVs）分泌、免疫调节、自噬或肿瘤发生等过程中以多种方式调节其功能。ISG15 可由不同类型的细胞分泌，包括淋巴细胞和上皮细胞，从而通过诱导 IFN-γ 分泌来调节 NK 细胞和 T细胞的抗病毒反应。细胞外 ISG15 介导 CD8+ T 细胞的激活，对 CD4+ 和 CD8+ T细胞中 IFN-γ 分泌很重要。
关于先天免疫细胞，树突状细胞（DCs）在对各种病原体进行适当的免疫应答中起着关键作用。除了抗原呈递外，DCs 还通过分泌多种细胞因子来激活不同的免疫细胞。在感染过程中，PAMPs 被DCs中表达的Toll 样受体（TLRs）识别。这些 PAMPs 可以激活不同的信号通路，如 NF-kB，从而导致促炎细胞因子（如 IL-1β）的转录。在 IL-1β 分泌之前，proIL-1β 必须被Caspase-1裂解。Caspase-1 需要由多蛋白复合物 NLRP3 炎性小体激活。NLRP3 炎性小体与 Caspase-1 一起导致 proIL-1β 和 proIL-18 的切割，从而分泌这些促炎细胞因子。此外，TLR 启动后的 ISG15 诱导可能与 NLRP3 炎性小体的稳定性和活性有关。
一些研究的重点是破译 ISG15 在调节 T 细胞和 NK 细胞活化方面的功能，或揭示其在体内稳态中的作用以及它如何在小鼠模型中诱导协调免疫反应。然而，ISG15 调节 Caspase-1或炎性小体活性的机制及其与 DC 功能特性的潜在联系尚未得到详细探索。
近日，西班牙马德里自治大学医学系及国家心血管研究中心（CNIC）团队的最新研究旨在阐明这种蛋白质修饰剂在先天免疫细胞谱系中的功能作用。其结果表明，ISG15可以调节BMDCs的成熟和激活，ISG15 缺失会对它们介导CD8+ T细胞增殖和激活的能力产生负面影响，且ISG15 是 BMDCs 释放促炎细胞因子（如 IL-1β 和 IL-12）所必需的。这些结果揭示了 ISG15 在 BMDCs 中的新功能。研究成果发表于 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“ISG15 modulates inflammatory profiles and ability to activate CD8 + T cells in bone marrow-derived dendritic cells”。
首先，在评估 ISG15 在 BMDCs 中的作用之前，生成了来自 Isg15−/− 小鼠的 BMDCs。IFN-α 可诱导 WT 小鼠 BMDCs 中蛋白质 ISG化（ISGylation），但在 ISG15-KO 小鼠中未被诱导（图1 A）。然后，通过不同 TLR 激动剂，从细胞外配体如 LPS（TLR4）、Pam3CSK4（TLR2/1）、Pam2CSK4（TLR2/6）到细胞内配体如 pI: C（TLR3）、IMQ（TLR7/8）、CpG（TLR9），对 ISG15 在 BMDCs 上的诱导表达（和ISG化）进行了详细研究。与已报道的 ISG15 在抗病毒反应中的功能一致，当细胞受到基于 DNA/RNA 的 TLR 刺激时，观察到 Isg15 mRNA 表达较高，同时在 LPS 刺激12小时和24小时后其表达水平也显著升高（图1 B）。一致地，在 WT 小鼠中也观察到这些 TLR 激动剂处理后更高水平的蛋白质 ISG化以及细胞内游离的 ISG15，但在 Isg15−/− 小鼠中没有观察到（图1 C）。这些数据表明，在 BMDCs 中用 IFN-α 刺激后，细胞内 ISG15 被诱导，并且与其他 TLR 激动剂相比，LPS 可以诱导高水平的 ISG15。
图1 在小鼠BMDCs中用不同的PAMPs处理后诱导ISG15。
由于 LPS 诱导了最高水平的 ISG15，接下来，评估了 ISG15-KO BMDC 细胞响应 PAMP 的激活和成熟状态。实验监测了用 LPS 刺激的 WT 和 KO 小鼠的 BMDC 表面膜上活化标志物 CD40 和 CD86 的水平，结果表明，ISG15-KO BMDCs 在基线水平表达的 CD40+ 细胞比例略高，但显著高于对照组，表明其基础活化状态可能高于 WT DCs（图2 A）。尽管 ISG15-KO BMDCs 能够在 LPS 刺激下增加 CD40 的表达，但与 WT 小鼠相比，观察到 KO 细胞诱导 CD40 的能力显著降低，这表明诱导细胞成熟的效果较差（图2 A）。LPS 处理后 BMDCs 表达 CD86 的百分比没有观察到差异，但 CD86 的诱导能力略有下降（图2 A）。
在到达引流淋巴结（dLN）后，DC 的关键步骤是在免疫突触（IS）通过与 T 细胞的亲密接触来呈递抗原（Ag）。因此，研究人员试探索 ISG15 是否可能在 BMDC 介导的 T 细胞激活中发挥作用。为了解决这个问题，从 Isg15-WT 或 KO 小鼠中分化出 BMDCs，用卵清蛋白（OVA）注射，并与分别从 OVA Ag 特异性小鼠模型 OT-I 或 OT-II 中分离的初始 CD8+ T 细胞或初始 CD4+ T 细胞共培养（图2 B）。有趣的是，Isg15缺失小鼠的 BMDCs 激活72小时后 CD8+ T细胞的增殖显著减少，但在 CD4 +没有（图2 B）。此外，转染 ISG15-KO BMDCs 的 CD8+ T细胞的颗粒酶B 表达低于转染 WT BMDCs 的细胞（图2 C），从而表明细胞毒性 CD8+ T 细胞的激活存在缺失。然而，IFN-γ + CD8 T细胞保持不变（图2 C ）。因此，ISG15-KO BMDCs 介导细胞毒性 CD8+ T 细胞增殖和激活的能力降低。
进一步地，研究人员考虑了迁移在 ISG15-KO BMDC 中受到影响的可能性。为了检验这一假设，进行了 Transwell 测定在体外评估了 ISG15-KO BMDCs 在化学性诱导时响应 CCL21（一种在活化 DC 中高度表达的CCR7配体）的迁移能力。实验观察到，KO BMDCs 保留了响应 CCL21 的迁移能力。这些结果表明，ISG15 介导 DCs 的成熟，以及 CD8 + T 细胞的激活和增殖，但不介导DC迁移。
图2 ISG15-KO BMDCs的激活、增殖和抗原呈递能力。
最后，实验研究了 ISG15 在 BMDCs 用 LPS 刺激后 TLR 下游促炎细胞因子（如 IL-1β 和 IL-12）的表达和分泌中的作用。数据显示，在用 LPS 处理12小时和24小时后，ISG15-KO BMDCs 中 Il-1β 和 Il-12 mRNA 水平与 WT 相比没有差异（图3 A）。通过流式细胞术细胞内染色评估了这些细胞内细胞因子的水平，结果显示，IL-1β 和 IL-12 在 LPS 处理后的 WT 和 KO 中表达相似，尽管在培养 24 小时后观察到未处理的 ISG15-KO BMDCs 中 IL-1β+ 细胞的比例略有下降（图3 B）。有趣的是，在测量了 BMDC 培养物中分泌的 IL-1β 和 IL-12 的细胞外水平后，观察到 LPS 处理 12 小时和 24 小时后 ISG15-KO BMDC 上清液中这些细胞因子明显减少（图3 C）。此外，在 LPS 刺激下，ISG15-KO BMDCs 分泌的 IL-1β 比 IL-12 减少得多（图3 D）。
为了排除 NF-кB 通路或 NLRP3 炎性小体的缺失，还测定了 p65 磷酸化水平和 NLRP3 总水平。然而，在 LPS 刺激下 KO 与 WT BMDCs 中没有观察到这些蛋白质显著降低（图3 E）。因此，随后探索了 ISG15 KO 细胞可能存在 IL-1β 切割和成熟缺失的可能性。实验评估了 ISG15-KO BMDCs 中 Caspase-1 的水平，结果显示了 Procaspase-1 水平降低的趋势（图3 F）。这种减少似乎不是增强裂解成其活性形式的结果，而是 Procaspase 本身水平降低的结果。此外，Procaspase-1 水平与可溶性 IL-1β 水平呈正相关（图3 G），进一步支持Procaspase-1 的表达是有效分泌 IL-1β 所必须的。
基于先前的观察，研究人员想知道游离细胞外重组 ISG15 （rISG15）在调节 IL-1β 分泌水平中的作用可能是什么。通过将 rISG15 和 IL-12 添加到细胞培养物并经 LPS 处理 12 小时和 24 小时后，评估 Isg15 缺失 BMDCs 中 mRNA Il-1β 和细胞外 IL-1β 的水平。数据显示，在 rISG15 处理后，Il-1β 的 mRNA 水平增加。然而，在KO BMDCs 中添加 rISG15，IL-1β 的细胞外水平保持不变（图3 H）。通过添加多克隆抗-ISG15抗体阻断游离细胞外 ISG15 并没有显著改变 WT BMDCs 的 IL-1β 分泌量（图3 I）。这些结果表明，细胞内 ISG15 调节 Procaspase-1 的表达，这是 LPS 刺激后有效激活 IL-1β 所必需的。
图3 IL-1β 和 IL-12 在 ISG15-KO BMDCs 中的表达以及炎症小体活性。
总体而言，这项研究提供了 ISG15 在 DC 激活、促炎细胞因子分泌以及促进 CD8 + T 细胞扩增和激活中的关键功能的证据。结果表明，尽管激活标志物 CD40 的诱导显著减少，但 Isg15−/− BMDCs 的激活并未受到严重阻碍。尽管未来需要进一步的实验来证实 ISG15 和 Caspase-1 之间的相互作用，但该研究已经表征了 ISG15 在 BMDCs 分泌 IL-1β 和 IL-12 中的作用。因此，ISG15 调节关键炎症分子和适应性免疫反应的能力使其成为开发基于 DC 的新型免疫调节疗法的有前途的靶点。
参考文献：Martínez-Fleta P, Pertusa C, Fernández-Delgado I, Izquierdo-Serrano R, Ramírez-Huesca M, Fernández-Gallego N, Calzada-Fraile D, Moya-Ruiz E, Castillo-González R, Guerra S, Martín-Gayo E, Sánchez-Madrid F. ISG15 modulates inflammatory profiles and ability to activate CD8 + T cells in bone marrow-derived dendritic cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Oct 24;82(1):362. doi: 10.1007/s00018-025-05849-9. PMID: 41134371.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41134371/
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ISSN:1420-682X (Print);1420-9071 (Electronic)
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