Alexa Fluor 555 酪胺共轭物多重荧光标记实验的原理和过程

保存条件：避光、-20°C储存，避免反复冻融

英文名称：AF555 Tyramide Conjugates ；AF555 TSA Conjugates

中文名称：Alexa Fluor 555 酪胺缀合物；Alexa Fluor 555 酪胺共轭物

激发波长Ex(nm)：555

发射波长Em(nm)：565

外观：固体

包装：瓶装

久久小常识(www.99xcs.com)™

AF555 Tyramide Conjugates（AF555酪胺偶联物）是一种基于酪胺信号放大（TSA）技术的高性能荧光探针，广泛应用于生物医学研究中的高灵敏度检测与成像。

结构组成

其分子结构主要由两部分通过稳定的共价键（如酰胺键）连接而成：

Alexa Fluor 555荧光染料：一种磺化罗丹明衍生物，属于苝菁类染料。

其激发波长（Ex）约为555 nm，发射波长（Em）约为565 nm，具有高亮度、优异的光稳定性和良好的水溶性。

酪胺（Tyramide）基团：一种含酚羟基的芳香胺化合物，其结构类似于酪氨酸。它是辣根过氧化物酶（HRP）的底物。

（一）实验原理

信号放大机制：

HRP 在过氧化氢（H2O2）存在下催化酪胺分子氧化，生成短寿命的高活性自由基。这些自由基与靶标蛋白周围的酪氨酸、色氨酸等残基共价结合，使大量荧光基团（如 AF555）沉积在抗原位点，实现信号几何级放大（灵敏度提升 10-100 倍）。

多重标记实现：

通过循环操作（每轮针对一个靶标），在每轮 TSA 反应后彻底灭活 HRP 并剥离抗体，避免轮间交叉反应，从而在同一样本上依次标记多个靶标。AF555 的发射光谱（～565 nm）与其他荧光染料（如 AF488、Cyanine 5.5）光谱分离度高，有效减少串色。

（二）实验流程

样本预处理

固定与透化：

组织或细胞样本用 4% 多聚甲醛固定（15 分钟，室温），0.1%-0.5% Triton X-100 透化（10 分钟）。

封闭：

使用 5% BSA 或脱脂牛奶封闭非特异性结合位点（室温 30-60 分钟）。

第一轮标记循环

一抗孵育：

滴加针对第一靶标的一抗（如兔源抗体），4℃ 过夜或室温孵育 1 小时。

HRP 二抗孵育：

洗净后加入 HRP 标记的二抗（如抗兔-HRP），室温孵育 30-60 分钟。

TSA 反应：

将 AF555 Tyramide Conjugates 用 DMSO 溶解后，以扩增缓冲液（含 0.003% H2O2 的 TBST）稀释至工作浓度（通常 1:200–1:1000）。

滴加至样本，避光反应 5-10 分钟（室温）。

HRP 灭活与抗体剥离：

用 0.01 M HCl 处理 10 分钟彻底灭活 HRP。

通过热介导（微波处理 10 分钟）或甘氨酸-HCl 缓冲液（pH 2.0）剥离抗体。

后续循环

重复上述步骤（更换针对新靶标的一抗、二抗及不同荧光酪胺，如 Cyanine 5.5），通常可完成 3-5 轮标记。

最终处理与成像

核染色：

使用 DAPI 或 Hoechst 复染细胞核（室温 10-15 分钟）。

封片与成像：

荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像，注意避免荧光淬灭。

ICG-carboxylic acid

TRITC Phalloidin

Cy5 Phalloidin

Alexa Fluor 647 NHS

Sulfo-Cy5 bis-NHS ester

5-Ethynyl-Uridine CE-Phosphoramidite

5-Ethynyl-dU CE-Phosphoramidite

5-Hydroxymethyl-dC CE-Phosphoramidite

5,N4-Etheno-dC CE-Phosphoramidite

Amino Modifier 15-dT CE-Phosphoramidite

N2-Ethyl-dG CE-Phosphoramidite

5'-MMT-Amino Modifier C12 CE-Phosphoramidite

（本文内容由陕西新研博美生物科技有限公司木南整理）